科佰生物

科佰生物針對(duì)以上應(yīng)用開發(fā)對(duì)應(yīng)的檢測(cè)試劑盒，配套科佰生物的參考品，對(duì)試劑盒做性能評(píng)價(jià)，如下我們以EGFR T790M為例：

待測(cè)樣本：20個(gè)陰性樣本和1個(gè)NTC。分別將投入量設(shè)置為10ng和40ng，每個(gè)樣本做兩個(gè)重復(fù)進(jìn)行Bio-Rad數(shù)字PCR檢測(cè)。

由上數(shù)據(jù)可見：無論是10ng還是40ng，LOB控制在2拷貝以內(nèi)（一般噪音拷貝為5以內(nèi)），雜點(diǎn)不呈現(xiàn)劑量的依賴，是隨機(jī)產(chǎn)生的噪音信號(hào)。

待測(cè)樣本：10個(gè)NGS驗(yàn)證為陽性的樣本（編號(hào)1-10）;  10個(gè)NGS驗(yàn)證為陰性的樣本（編號(hào)11-20）。對(duì)20個(gè)樣本分別使用數(shù)字PCR檢測(cè)。

由上數(shù)據(jù)可見：

①測(cè)試10個(gè)NGS陽性樣本,檢測(cè)結(jié)果均為陽性，陽性符合率100%，并定量檢出變異頻率。

②測(cè)試10個(gè)NGS陰性樣本,檢測(cè)結(jié)果均為陰性，陰性符合率100%，定值變異頻率均為0%。

1、投入量與拷貝數(shù)、頻率之間的線性測(cè)試

首先選取50%突變頻率的EGFR T790M標(biāo)準(zhǔn)品(CBP10402)，該標(biāo)準(zhǔn)品是通過基因編輯，二等位基因，CN=2，編輯一條為mutation，一條為WT，經(jīng)過理論值計(jì)算、Sanger測(cè)序、Bio-Rad DdPCR試劑盒（Assay ID: dHsaCP2000019）共同驗(yàn)證，確認(rèn)為50%的頻率。

1.1 投入量在0.1ng~200ng間設(shè)置10個(gè)梯度，進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(cè)（2復(fù)孔），分別考量FAM拷貝數(shù)與投入量是否線性相關(guān)、VIC拷貝數(shù)與投入量是否線性相關(guān)；

1.2 投入量在0.1ng~200ng間設(shè)置10個(gè)梯度，進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(cè)（2復(fù)孔），判斷是否滿足%AF=50±10%波動(dòng)。

由上數(shù)據(jù)可見：

①200 ng投入量過大，拷貝數(shù)不呈現(xiàn)線性，雖然滿足45-55%范圍，但是不適合做單一通道的拷貝數(shù)判定；

②0.1 ng投入量過小，拷貝數(shù)不呈現(xiàn)線性，同時(shí)42.59%也低于45%，不適合做單一通道，也不適合做雙通道；

因此：范圍為0.5-100ng。

2、線性稀釋不同頻率理論值與檢測(cè)值的線性測(cè)試

根據(jù)以上結(jié)論，我們選取10ng作為進(jìn)一步的%AF線性范圍探索，首先使用EGFR T790M的對(duì)應(yīng)的陰性標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)50%的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行有限稀釋，0.1%-50%間設(shè)置9個(gè)AF梯度，進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(cè)（2復(fù)孔）。

由上數(shù)據(jù)可見：在10ng的投入量下，AF%呈現(xiàn)非常好的線性稀釋，存在波動(dòng)，但是都在誤差范圍內(nèi)。

我們可以通過理論計(jì)算來預(yù)測(cè)下可能的檢測(cè)限范圍。當(dāng)控制拷貝在15000（對(duì)應(yīng)50ng input）以內(nèi)時(shí)LOB數(shù)據(jù)是2，2/15000=0.0133%，預(yù)測(cè)檢測(cè)限為0.0200%。

在如此低頻的情況下，臨床適用場(chǎng)景適合ctDNA，一般來說臨床上10ml全血，一般中位值ctDNA是20-40ng，取低值20ng。20ng 理論值6000個(gè)拷貝數(shù)，2/6000=0.0333%，預(yù)測(cè)檢測(cè)限為0.0500%。

0.05%的誤差范圍是±50%，就是0.025-0.075%，因此我們選擇3個(gè)點(diǎn)，探尋LOD分別為 0.010%、0.050%、0.100%，要求95%檢出。

0.010%  

對(duì)20個(gè)0.01%的樣本進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(cè)，觀察在0.005-0.015%以內(nèi)是否達(dá)成95%檢出。

0.05%  

對(duì)20個(gè)0.05%的樣本進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(cè)，觀察在0.025-0.075%以內(nèi)是否達(dá)成95%檢出。

0.1%  

對(duì)20個(gè)0.1%的樣本進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(cè)，觀察在0.05-0.15%以內(nèi)是否達(dá)成95%檢出。

由上數(shù)據(jù)可見：選擇0.05%作為該檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)限LOD。

選取強(qiáng)陽性2%樣本20個(gè)，中陽性1%樣本20個(gè)，弱陽性0.2%樣本20個(gè)分別進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(cè)。

由上數(shù)據(jù)可見：強(qiáng)陽性2% 、中陽性1% 、弱陽性0.2%三種檢測(cè)體系下，誤差均在合理的范圍內(nèi)，精密度良好。

首先使用EGFR T790M的對(duì)應(yīng)的陰性標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)50%的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行有限稀釋，每個(gè)梯度使用陰性樣本兩倍稀釋，接著對(duì)11個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)。

由上數(shù)據(jù)可見：當(dāng)AF在0.05%-50%范圍內(nèi)，對(duì)應(yīng)的回收率在80-120%范圍，符合預(yù)期。

取10個(gè)不同AF（1%~50%）的標(biāo)準(zhǔn)品樣本，分別安排實(shí)驗(yàn)員A、實(shí)驗(yàn)員B在同一天，每人進(jìn)行四次檢測(cè)。

由上數(shù)據(jù)可見：EGFR T790M檢測(cè)體系是穩(wěn)定可重復(fù)的檢出的。

取10個(gè)不同AF（1%~50%）的標(biāo)準(zhǔn)品樣本，分別安排①實(shí)驗(yàn)員A、實(shí)驗(yàn)員B在同一天進(jìn)行每人四次實(shí)驗(yàn)測(cè)試；②實(shí)驗(yàn)員A在第一天、第二天分別進(jìn)行四次實(shí)驗(yàn)測(cè)試；③實(shí)驗(yàn)員A在第一天進(jìn)行四次實(shí)驗(yàn)測(cè)試，實(shí)驗(yàn)員B在第二天進(jìn)行四次實(shí)驗(yàn)測(cè)試。

由上數(shù)據(jù)可見：EGFR T790M檢測(cè)體系是穩(wěn)定可重復(fù)的在不同人、不同時(shí)間檢出，重現(xiàn)的。